Molekulárne biologické metódy výskumu a ich použitie

Molekulárne biologické metódy výskumu hrajú dôležitú úlohu v modernej medicíne, forenznej vedy a biológie. Vďaka pokrokom v štúdiu DNA a RNA, je človek schopný preskúmať genómu organizmu určiť pôvodcu, rozpoznať požadovanej nukleovej kyseliny v zmesi kyselín, atď

Molekulárne-biologické metódy. Čo je to?

Späť v 70-80s týchto vedcov bol prvý dešifrovať ľudský genóm. Táto udalosť dala impulz k rozvoju genetického inžinierstva a molekulárnej biológie. Štúdium vlastností DNA a RNA, znamená, že je teraz možné použiť tieto nukleovej kyseliny za účelom diagnózy ochorenia, štúdie génu.

Príprava DNA a RNA

Molekulárne biologické diagnostické metódy vyžadujú východiskový materiál: často sa nukleové kyseliny. Existuje niekoľko spôsobov, ako vybrať tieto látky z buniek živých organizmov. Každý z nich má svoje výhody a nevýhody, a to je potrebné brať do úvahy pri výbere metódy izolácie nukleových kyselín v čistej forme.

1. Príprava DNA Marmur. Spôsob spočíva v tom, že sa na zmes alkoholu látok, vyzráža výsledná čistá DNA. Nevýhodou tejto metódy je použitie korozívnych látok, fenolu a chloroformu.

2. Izolácia DNA na ramena. Hlavné látka, ktorá sa tu používa - je guanidínu Tiokyanatan (GuSCN). To podporuje usadzovanie deoxyribonukleovej kyseliny na špecializovaných podklady, z ktorých môže byť následne zhromaždené pomocou špeciálneho pufra. Avšak GuSCN - je inhibítor TCP, a dokonca aj malý podiel, ktorý sa uloží v DNA môže ovplyvniť priebeh polymerázovej reťazovej reakcie, ktorá je dôležitá pri práci s nukleovými kyselinami.

3. Zrážanie nečistôt. Spôsob sa líši od predchádzajúcej, sa tým, že molekuly samy o sebe nie sú uložené kyselinu dehoksiribonukleinovoy a nečistoty. Ak to chcete urobiť, použite iónomeničov. Nevýhodou je, že nie všetky látky môžu usadiť.

4. skríningu. Táto metóda sa používa v prípadoch, kedy nie je nutné mať presné informácie o štruktúre molekuly DNA, a že je potrebné získať niektoré štatistiky. Dôvodom je to, že konštrukcia nukleovej kyseliny, môže dôjsť k poškodeniu pri manipulácii s detergenty, najmä alkálií.

Klasifikácia výskumných metód

Všetky molekulárne-biologické metódy výskumu sú rozdelené do troch hlavných skupín:

1. Amplifikácia (pomocou množstva enzýmov). To zahŕňa PCR - polymerázová reťazová reakcia, ktorá hrá dôležitú úlohu v mnohých diagnostických metód.

2. Neamplifikatsionnye. Táto skupina metód je spojená priamo s prácou zmesou nukleových kyselín. Príklady sú 3 druhy blot, in situ hybridizácia, atď

3. Metódy založené na uznaní signálu z molekuly sondy, ktorá sa viaže na špecifickú DNA alebo RNA sondy. Príklad - hybridizačný systém hybridné riešenie záchytným systémom (HC2).

Enzýmy, ktoré môžu byť použité v molekulárnej výskum metód biologických

Mnoho molekulárnej diagnostické postupy zahŕňajú použitie širokej škály enzýmov. Nižšie sú najčastejšie používané:

1. reštrikčné enzým - "cut" molekuly DNA do potrebných častí.

2. DNA polymerázy - syntetizuje molekulu dvojvláknové deoxyribonukleovej kyseliny.

3. Reverzný transkriptáza (reverznej transkriptázy) - použiť pre syntézu DNA z templátu RNA.

4. DNA LIGÁZA - je zodpovedný za tvorbu fosfodiesterových väzieb medzi nukleotidy.

5. exonukleázovou - odstráni nukleotidy od koncových častiach molekuly deoxyribonukleovej kyseliny.

PCR - základná metóda amplifikácie DNA

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je široko používaný v modernej molekulárnej biológie. Táto metóda, v ktorej môže byť jedna molekula DNA, získaná veľký počet kópií (amplifikácie molekuly).

Hlavné funkcie PCR:

- diagnostika ochorenia;

- klonovanie DNA segmenty, gen.

Pre vykonanie polymerázová reťazová reakcia vyžaduje nasledujúce prvky: počiatočné molekula DNA, termostabilné DNA polymerázu (Taq alebo PFU), deoxyribonukleotidy fosfáty (zdroje dusíkových báz), priméry (2 primer 1 molekulu DNA), a sama o sebe vyrovnávací systém, ktorý môže vykonávať všetky reakcie.

PCR sa skladá z troch krokov: denaturácia, nasadnutie primérov a predĺženie.

1. denaturácia. Pri teplote 94-95 stupňov Celzia proshodit rozbiť vodíkové väzby medzi oboma reťazcami DNA, a ako výsledok dostaneme dve jednoreťazcová molekuly.

2. napojené primery. Pri teplote 50-60 ° Celzia dochádza prístupové priméry na koncoch molekuly jednořetězcových nukleových kyselín podľa typu komplementarity.

3. Predĺženie. Pri teplote 72 stupňov sa syntetizuje dcérou dvouřetězcová molekuly deoxyribonukleovej kyseliny.

DNA sekvenovanie

Molekulárne biologické metódy výskumu často vyžaduje znalosť sekvencie nukleotidov v molekule kyseliny deoxyribonukleovej. Pre stanovenie genetického kódu sekvenované. Molekulárna diagnostika budúcnosti bude vychádzať z poznatkov získaných pri stanovení ľudskej sekvencie.

Nasledujúce typy sekvenovania:

• sekvenovania podľa Maxam-Gilbert;
• Sanger sekvenovania;
• pyrosekvenování;
• nanoporovoe sekvenovania.